وجه افتراق Real Time PCR با PCR نوع معمولی به کار گرفتن یک نشانگر فلورسنت در واکنش جهت ردیابی محصول واکنش می باشد. این گزارش‌گرها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در صورت تکثیر DNA نور تولید کنند. لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. به اولین چرخه‌ای که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه (Threshold)باشد چرخۀ آستانه یا CT گویند. عدد CT با مقدار الگوی اولیه رابطۀ معنی داری دارد و از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را تخمین زد. به عبارت دیگر در فاز اولیه مرحله تصاعدی مقدار فلورسنت افزایش می یابد تا به آستانهای می رسد که به مقدارمشخصی از سطح background بالاتر است، این چرخه ( سیکلی از PCR که قطعه تکثیر از حد آستانه عبور می کند) به عنوان CT شناخته می شود.
به طور کلی Real time PCR چند مرحله دارد که عبارت است از:
1- Baseline rgion : در این مرحله هیپ گونه نوری قابل رویت نیست.
2- Exponential phase : محصول دو رشته ای در هر چرخه دو برابر می شود و رشد تصاعدی مربوط به واکنش آغاز می شود.
3- The liner phase: ترکیبات واکنش و کارایی آنها روبه اتمام است.
4- The plateau phase: ترکیبات واکنش از بین می روند و افزایشی در میزان فلورسنت مشاهده نمی شود.
روش Real time PCR می تواند به دو صورت One step ( همزمان در یک واکنش ساخت cDNA از RNA و تکثیر آن صورت می گیرد) و Two step ( ابتدا ساخت cDNA و در واکنش دیگر تکثیر آن ) انجام میشود.
روش‌های شناسایی در PCR Real time
در سالیان اخیر دستگاههای چند کاناله تولید و عرضه شدند که این دستگاه‌ها قادرند به صورت همزمان چندین طول موج نوری متفاوت را تابانیده و بازتابش آن را ثبت نمایند. دراین تکنیک ، برای تعیین غلظت DNA از رنگهای فلورسانس و یا شاخص های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس استفاده میشودکه به برخی از مهمترین آنها اشاره میشود:
رنگهای فلورسنت متصل شونده به DNA : شاید متداولترین رنگ مورد استفاده در این تکنیک سایبرگرین باشد. این رنگ به شیارهای کوچک DNA دورشته‌ای متصل میشود و با جذب در طول موج 498 نانومتر، نور 522 نانومتری را ساطع می‌کند که توسط دستگاه ثبت میشود. در طی PCR که محصول دو رشته ای تولید میشود، رنگ به آنها متصل می شود و بنابراین افزایش شدت فلورسنت با غلظت dsDNA متناسب است. سایبرگرین یک رنگ غیر اختصاصی است لذا برای تمامی آزمایشات قابل استفاده است و این مسئله یک مزیت به شمار می‌آید اگرچه مهمترین عیب آن عدم توانایی در افتراق DNA 2 رشته ای اختصاصی از پرایمر دایمر ها می باشد که برای حل این مشکل استفاده از منحنی ذوب (Melting curve) پس از انجام مراحل PCR توصیه شده است.
پروب‌های فلورسنت: پروبها بر خلاف سایبرگرین I بر اساس تشخیص اختصاصی توالی محصول کار می‌کنند. پروبها معمولاً یک رنگ فلورسنت (Reporter) و یک رنگ خاموش کننده (Quencher) دارند. معمولاً دستگاه‌ها بازتابش رنگ فلورنس‌ت را بررسی می‌نمایند .حضور خاموش کننده در نزدیکی موقعیت فلورسنت موجب جذب نور آن و خاموش شدن آن میشود لذا در این حالت بازتابشی در دستگاه ثبت نمی‌شود. از جمله این پروب ها می توان به Taqman، scorpion و … اشاره نمود.
آنالیزهای کمی در Real time PCR
دو روش عمده برای بررسی کمی در time PCR Real وجود دارد:
1- روش منحنی استاندارد (مقایسۀ مطلق)
در این روش از نمونۀ RNA یا DNA با غلظت مشخص برای رسم منحنی استاندارد استفاده میشود. غلظت RNA یا DNA استاندارد با اسپکتروفوتومتر (nm260) تعیین میشود و سپس از روی وزن مولکولی نمونه به تعداد نسخه‌های آن تبدیل میشود. استانداردهای غلظتی ژن‌های معروف به صورت تجاری قابل خریداری است هرچند که بسیار گران قیمتند. از نمونه های استاندارد سری رقعت تعیین کرده و همراه با نمونه هدف در دستگاه Real-time PCR قرار می دهیم با استفاده از Ct که دستگاه برای هر رقت به ما می دهد یک منحنی رسم کرده که X آن رقت یا تعداد کپی از ژن و Y آن CT باشد، نمودار به دست امده یک نمودار خطی است که با قرار دادن عدد نمونه هدف در نمودار غلظت یا تعداد کپی آن نیز بدست می آید. ترجیحا طول قطعه استاندارد مساوی با طول قطعه هدف باشد.
2- روش آستانه نسبی (مقایسۀ نسبی)
برای حذف نوسانات مقادیر RNA وارد شده در واکنش و خطاهای عملکرد دستگاه‌ها و فرد از استانداردهای داخلی استفاده میشود. این استانداردها باید در همۀ بافت‌ها بیان ثابت داشته باشند و آزمایش ما نباید بیان آن را نسبت به نمونۀ کنترل تغییر دهد. بدین منظور از ژن هایی تحت عنوان Hous keeping genes مانند بتا اکتین و GAPDH استفاده میشود. بیان این ژن ها ثابت است و از مقایسه نمونه تیمار شده با شاهد و کنترل داخلی می توان کاهش یا افزایش بیان را مشاهده کرد.
منحنی ذوب
جهت بررسی فرایند PCR و همچنین انجام موارد ژنوتایپینگ از منحنی ذوب استفاده می شود. به این ترتیب که از دمای پایین تر از دمای اتصال تا دمای بالاتر از 95 درجه سانتی گراد را در نظر گرفته و برنامه مربوط به آن را به دستگاه می دهیم، تا به ازای هر نیم درجه سانتی گراد لامپ روشن شود و شدت جذب فلورسنت را قرائت کند این باعث می شود که برای تمام قطعات تکثیر شده پیک جذب رسم شود. به این ترتیب در صورت وجود آلودگی از طریق دیدن پیک جذب آن را شناسایی می کنیم. در دمایی پایین
پیک های که رسم می شود مربوط به دایمر آغازگر است و آخرین پیک مربوط به قطعه مورد نظر ماست.
تشخیص پلی مرفیسم توسط Real time PCR
استفاده از این تکنیک اجازه تعیین SNPS) Single nucleotide polymorphism) را به ما می دهد. مانیتور کردن همزمان پروسه تکثیر و تعیین ژنوتیپ با استفاده از هیبریداسیون پروبها و با آنالیز منحنی ذوب امکان پذیر می شود. موتاسیون نقطه ای بوسیله آنالیز منحنی ذوب تشخیص داده میشود. دمای بحرانی Tm که در آن DNA تک رشتهای میشود یک شناساگر برای وجود یا عدم وجود موتاسیون میباشد. پروب اختصاصی برای ناحیه موتانت تهیه می شود در دمای پایین پروب به ناحیه های غیر اختصاصی متصل می گردد و با افزایش دما پروب اختصاصی تر عمل می کند، منحنی ذوب حاصل از این واکنش را آنالیز می کنیم تا متوجه وجود یا عدم وجود موتاسیون شویم .
اصطلاحات موجود در Real time PCR
Standard Curve: منحنی استاندارد جهت آنالیزهای کمی
CT: به اولین چرخه‌ای که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه (Threshold)باشد چرخۀ آستانه یا CT گویند
Baseline: خط زمینه، جایی که هیپ گونه نور فلورسنتی قابل ثبت نیست.
Amplification plot: نموداری که در آن تعداد چرخه ها در مقابل شدت فلورسنت رسم می شود.
http://urmiabreeder.ir :منبع
